近日，亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室、华南农业大学生命科学学院、岭南现代农业科学与技术广东省实验室刘耀光院士团队在国际知名植物生物学学术期刊《Journal of Integrative Plant Biology》（IF2020=7.061，生物学一区）在线发表题为“The ScCas9++ variant expands the CRISPR toolbox for genome editing in plants”的研究论文（论文链接地址：https://www.jipb.net/EN/10.1111/jipb.13164）。该研究利用来源于狗链球菌的优化的CRISPR/ScCas9++新变体，开发了广靶向的植物基因组编辑与胞嘧啶单碱基编辑器，为植物功能基因组学研究和作物遗传改良提供了新的研究工具。

　　目前，CRISPR/Cas基因组编辑技术已成为功能基因组学研究和作物遗传改良的重要工具。但其编辑范围常受到PAM基序及其编辑窗口的限制。因此，开发具有更广泛PAM识别范围的Cas变体是扩大CRISPR/Cas系统编辑使用范围的一个重要研究方向。ScCas9是来源于狗链球菌（Streptococcus canis）的Cas9蛋白，与目前最常用的SpCas9蛋白（Streptococcus pyogenes,识别NGG-PAM）具有89.2%的高度相似性，识别靶向范围更广的NNG-PAM，但其在动、植物中的编辑效率都较低，难以推广使用。前人通过对ScCas9的PAM-DNA互作结构域和loop基序中的氨基酸进行替换，获得了进化型的ScCas9+和ScCas9++变体，并在动物细胞中表现出高的编辑活性和广的编辑范围。然而ScCas9+和ScCas9++变体在植物中的编辑能力如何仍然不清楚。
　　为了扩展植物CRISPR/Cas系统的靶向范围，刘耀光院士团队根据水稻密码子偏好性优化了ScCas9及其两个进化的ScCas9+和ScCas9++变体的编码DNA序列，系统地研究了它们对22个靶位点的编辑效率。结果发现ScCas9++的编辑效率比ScCas9和ScCas9+效率更高，但是它主要识别NGG-PAM靶点，而其它NNG靶点识别能力很低。该团队利用编辑效率最高的缺刻酶变体ScCas9n++构建了一个具有evoBE4max结构的新的胞苷碱基编辑器(CBE)PevoCDA1-ScCas9n++，在NNG-PAM上实现了稳定高效C−T的多重碱基编辑，并具有更宽的编辑窗口（C-1–C17），且没有靶点序列的偏好。进一步利用PevoCDA1-ScCas9n++对OsWx（3靶点）和OsEui1（2靶点）同时进行多靶点编辑，高效地产生了直链淀粉含量降低的新的优异水稻种质。

evoCDA1-ScCas9n++的结构(A)及其碱基编辑特性(B, C, D, E, F)

　　该研究为ScCas9++变体在植物基因组编辑中的进一步开发与应用打下了基础、提供了思路。其缺刻酶变体ScCas9n++在碱基编辑器开发中具有更大的应用潜力。此CBE编辑器PevoCDA1-ScCas9n++为多靶点的单碱基编辑提供更为有效的工具，有望在基因功能筛选、大规模饱和突变、编辑调控元件、引入提前终止密码子或进行可变剪接等研究中有广泛应用。
　　华南农业大学生命科学学院硕士研究生刘涛利和博士后曾栋昌为论文的共同第一作者，刘耀光院士和祝钦泷教授为论文的共同通讯作者。该研究获得广东省基础与应用基础研究重大项目、国家自然科学基金项目和广东特支计划科技创新青年拔尖人才专项的资助。（文/ 赵秀彩）