近日，广西大学生命科学与技术学院/亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室罗继景教授团队在水稻耐冷机制研究领域取得重要成果。该成果以题为“Natural variation in OsbHLH150 confers chilling tolerance in rice by increasing ABA biosynthesis”的论文在国际知名学术期刊Plant Communications在线发表。水稻作为全球最重要的粮食作物之一，对低温十分敏感。低温冷害常导致水稻减产，严重威胁粮食安全。因此，解析水稻低温胁迫响应的分子网络，对于培育耐冷性强的水稻品种至关重要。该团队利用耐冷粳稻品种“越光”（Koshihikari）和低温敏感型籼稻品种“Nona Bokra”杂交构建的染色体片段替换系，定位并克隆了控制水稻苗期耐冷表型的关键QTL CSS12b；该位点上的OsbHLH150被确定为候选目的基因，两亲本的OsbHLH150等位基因间存在6个 SNP变异，导致其编码的蛋白存在六个氨基酸的改变。OsbHLH150的敲除和互补实验证实了该基因正调控水稻苗期耐冷。我们最终阐明了一个由OsbHLH150介导调控的关键耐冷新途径: OsMAPK3 通过与 OsbHLH150 的互作并将其磷酸化并使其稳定；OsbHLH150 直接结合并激活OsNCED3的表达，从而通过提升 ABA 的生物合成来增强水稻的耐冷性。研究还发现，OsbHLH150 蛋白第 471 位的缬氨酸（valine）残基对其转录激活活性至关重要，粳稻和籼稻在该位点的氨基酸变异（缬氨酸与亮氨酸），是导致耐冷差异的重要原因。我们的研究不仅阐明了低温胁迫条件下OsbHLH150调控水稻ABA的合成并进而提高水稻耐冷性的分子机制，也为培育耐冷型水稻提供了精准的育种靶点。
1. OsbHLH150的图位克隆
团队利用耐冷粳稻品种“越光”（Koshihikari）和低温敏感型籼稻品种“Nona Bokra”杂交构建的染色体片段替换系，定位并克隆了控制水稻苗期耐冷表型的关键QTL CSS12b；该位点的OsbHLH150被确定为候选目的基因，两亲本的OsbHLH150等位基因存在6个 SNP变异，导致其编码的蛋白存在六个氨基酸的改变。OsbHLH150的敲除和互补实验证实了OsbHLH150正调控水稻苗期耐冷（Figure. 1）。
Figure. 1 Map-based cloning of OsbHLH150.
2. OsbHLH150的基因功能鉴定与互作蛋白验证
根据水稻基因组注释，OsbHLH150是一个编码bHLH家族转录因子的蛋白。为了阐明OsbHLH150的功能，我们首先通过RT-qPCR技术发现OsbHLH150受到冷诱导，亚细胞定位结果显示其定位于细胞核中，佐证了它作为一个转录因子的可能性。转录活性的实验进一步证实OsbHLH150是一个具有转录激活作用转录因子。通过酵母双杂交文库筛选，我们获得了一个与OsbHLH150发生相互作用的磷酸激酶OsMAPK3，并通过多种实验进一步证明了两者之间的物理互作（Figure. 2）。
Figure. 2 Characterization of OsbHLH150.
3. 低温胁迫下OsMAPK3介导了OsbHLH150的磷酸化
OsMAPK3是一个编码具有磷酸激酶活性蛋白的基因，我们推测OsMAPK3与OsbHLH150的相互作用可能使OsbHLH150发生了磷酸化。随后的实验也证实了OsMAPK3可以使OsbHLH150发生磷酸化并且受到低温的诱导。为了进一步探究OsbHLH150发生磷酸化的位点，通过在线工具Group-based Prediction System (GPS) 6.0 (http://gps.biocuckoo.cn/index.php)进行了预测，发现了三个潜在的磷酸化位点，分别为S669，S674和 S734。通过对这三个磷酸化位点进行点突变，然后进行体外磷酸化分析，结果发现当三个位点同时突变为丙氨酸以后OsbHLH150的磷酸化就消失了，并且在水稻叶片原生质体中进行体内实验也证实了这一结果 （Figure. 3）。因此，OsbHLH150蛋白中的S669，S674和 S734是受OsMAPK3激酶磷酸化的关键位点。
Figure. 3 OsMAPK3-mediated phosphorylation of OsbHLH150 under chilling stress.
4. OsMAPK3介导的磷酸化增强了OsbHLH150的稳定性
已有研究报道显示，蛋白质的磷酸化在调节蛋白稳定性方面发挥着重要作用。因此，OsbHLH150的磷酸化也可能影响了OsbHLH150蛋白的稳定性。为了评估磷酸化的影响，我们首先检测了OsbHLH150的蛋白质丰度，发现由过表达OsMAPK3转基因材料制备的原生质体受到冷处理后OsbHLH150的蛋白质丰度显著增加。随后的实验也证明了磷酸化增强了OsbHLH150的稳定性，抑制了其泛素化降解。进一步探索发现籼稻背景的OsbHLH150与OsMAPK3结合能力减弱，导致其磷酸化程度和蛋白稳定性均低于粳稻背景的OsbHLH150蛋白（Figure. 4）。
Figure. 4 OsbHLH150 is stabilized by OsMAPK3-mediated phosphorylation.
5. 低温胁迫下双突变体CR-OsMAPK3/ CR-OsbHLH150以及OsbHLH150S3A 和 OsbHLH150S3D 转基因株系的表型分析
为了进一步明确OsMAPK3与OsbHLH150的遗传关系，我们构建了CR-OsMAPK3/ CR-OsbHLH150双突变体。低温表型鉴定结果显示双突变体对于低温胁迫最敏感，且双突变体与CR-OsMAPK3表型更接近，说明OsMAPK3位于OsbHLH150的下游。在CR-OsbHLH150突变体中分别回补了OsbHLH150S3A和OsbHLH150S3D这两个突变等位基因的株系中， 回补了OsbHLH150S3D的株系耐冷能力显著提高，而回补了OsbHLH150S3A的株系则仍然表现为冷敏感表型。说明磷酸化的OsbHLH150提高了水稻的耐冷 (Figure. 5)。
Figure. 5 Phenotypic analysis of double mutant CR-OsMAPK3/ CR-OsbHLH150 and transgenic lines of OsbHLH150S3A and OsbHLH150S3D under chilling stress.
6. 磷酸化的OsbHLH150通过结合OsNCED3的启动子增强ABA的合成
已有报道显示，bHLH家族的蛋白可以调控ABA的合成，并且ABA与水稻耐冷密切相关。基于这一线索，我们检测了敲除OsbHLH150突变体中的ABA含量，结果发现，在冷胁迫下突变体叶片中的ABA含量显著低于野生型日本晴（NIP）。通过RT-qPCR检测发现ABA合成酶关键基因OsNCED3的表达在野生型和OsbHLH150敲除突变体中存在明显差异。后续的实验我们进一步证明OsbHLH150可以结合在OsNCED3启动子的E-box(CACATG)上激活OsNCED3的表达。更有趣的是，我们通过LUC实验证明了当OsMAPK3和OsbHLH150同时存在的时候，磷酸化会进一步增强OsNCED3的表达。此外，为了明确OsbHLH150与OsNCED3两者的遗传关系，我们构建了CR-OsNCED3/CR-OsbHLH150 和CR-OsbHLH150/OE-OsNCED3这两种突变体材料。低温表型鉴定显示，相比于野生型，双突变体CR-OsNCED3/CR-OsbHLH150对低温胁迫极其敏感，而在敲除OsbHLH150突变体中过表达OsNCED3则可以回补其冷敏感表型，并且敲除了OsNCED3的突变体表型与双突变体表型更接近。结果说明OsNCED3位于OsbHLH150的下游 (Figure. 6)。
Figure. 6 OsMAPK3-mediated phosphorylation of OsbHLH150 directly binds to OsNCED3 promoter to enhance OsNCED3 expression to improve chilling tolerance.
7. 基于单倍型分析发现调控OsbHLH150转录活性的SNP以及调控模型
鉴于粳稻的耐冷能力显著强于籼稻，我们对OsbHLH150基因进行了单倍型分析。实验的结果显示了Hap III是优势单倍型，而Hap I（越光单倍型）和 Hap VII（Nona Bokra单倍型）在所分析群体中占的比例较小。Hap I 主要存在于粳稻中， Hap VII 则是籼稻所特有的。序列变异分析发现，1203027368位点突变是一个关键突变，该突变导致OsbHLH150 蛋白第 471 位的缬氨酸（valine）突变为亮氨酸（leucine），影响了OsbHLH150转录因子活性（Figure. 7）。
综上所述，OsMAPK3-OsbHLH150-OsNCED3调控模块，通过OsMAPK3磷酸化OsbHLH150并增强其稳定性，进而激活OsNCED3的表达，提高了ABA的合成，增强了水稻的耐冷（Figure. 7G）。
Figure. 7 Haplotype-based discovery of a functional SNP regulating OsbHLH150 transactivation activity and working model is proposed for OsbHLH150.
本研究由广西大学在读博士孙津梁为第一作者，罗继景教授为通讯作者。本研究得到了国家自然科学基金（32260446/31671646）和广西科技计划项目（GuiKe-ZY23055027/2024GXNSFAA010473/2024GXNSFGA010003）等经费的支持。特别感谢中国科学院分子植物科学卓越创新中心林鸿宣院士提供关键群体材料。
原文链接：https://doi.org/10.1016/j.xplc.2026.101919
广西大学罗继景教授课题组长期围绕区域特色的广西普通野生稻资源的搜集、保护与利用开展研究。目前主要方向集中在耐冷、耐旱以及细菌性条斑病抗性基因的分子遗传研究。课题组已在 Nature Genetics、The Plant Cell、Nature Communications、Plant Biotechnology Journal、Plant Communications 等国际顶级期刊发表SCI论文30余篇。课题组常年招收遗传学、分子生物学和生物化学等方向的硕士、博士及博士后，欢迎优秀学子加入！
编辑 | 韦星璇
一审一校 | 黄婧
二审二校 | 王邕
三审三校 | 张积森
