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蛋白质组学平台简介
2015-04-02 17:44   审核人:

蛋白质组学平台是国家重点实验室大型仪器中心的子单元,在“十二五”期间,累计投资1000万元打造成规模化的仪器机组,现已成为我室最为完善的技术体系。蛋白质组学子单元致力于蛋白质组学相关技术的研究和开发,目标是为各课题组提供专业而完备的蛋白质组技术解决方案。现已可提供蛋白质样品全息制备、双向凝胶电泳分离、图像分析、液相色谱分离和质谱定量分析技术,即将引进的高分辨率质谱将为各课题组提供蛋白质修饰分析和代谢组学分析服务。

 

一、样品全息制备(Protein Sample Preparation)

蛋白质样品制备是蛋白质组研究的第一步,无论后续采用何种分离或鉴定手段,样品制备都是关键步骤。从蛋白质组学大规模研究的角度出发,样品制备应尽量获得所有蛋白质的信息。但是样品的来源千差万别,采取什么样的蛋白抽提方法则需要实践经验的积累。经过对蛋白质样品处理技术的优化,技术人员在样品处理上初步具备了处理多种来源样品的能力。目前成功制备的样品处理包括植物组织(如木薯根茎叶、、),动物组织(如肝癌、胃癌、肺癌、血管壁样品等),细胞(如Hela细胞、口腔鳞癌细胞等),微生物(如黄单胞菌、真菌等),体液(如脑脊液、血清、卵泡液等)、微量细胞(卵母细胞等)。

二、双向凝胶电泳(2DE)

 

双向凝胶电泳是将不同种类的蛋白质按照等电点和分子量差异进行高分辨率分离的分析方法,是目前使用最为广泛的蛋白质组研究手段。成功的双向电泳可以将1000到2000种蛋白质进行分离。通过对蛋白质双向电泳的图谱扫描,用相关软件(ImageMaster等)进行图谱差异分析,找到差异点。然后把差别点切出,进行脱色、酶解。最后样品进入质谱测试,得到质谱原始数据文件。通过搜库可得到差别点蛋白质的详细信息。

原理

1、根据蛋白质的等电点(第一向)和分子量(第二向)的不同进行分离。

2、电泳后根据蛋白质的上样量对胶进行考马斯亮兰染色、银染或荧光染色,然后用相关软件对电泳图象进行分析。

样品要求:

1、建议使用的蛋白质溶解体系为8M 尿素/4%CHAPS /40mMTris(Base)/65mM DTT;

2、样品浓度大于2 ug/ ul;

由于蛋白质组学涉及的样品范围很广,对于具体样品的要求请和项目经理联系。

 

仪器:

1st dimension:

IEF: IPGPhorIII (GE Healthcare) 和 Protean IEF (Bio-Rad)

2nd dimension:

GE Ettan DALTsix (26x20cm)

Hofer SE900 (26x20cm)

Hofer SE600 (17*13cm)

BioRad Decada (26x20cm)

2D凝胶图像分析软件

Image master 2D 5.0

 

三、荧光差异蛋白表达双向电泳分析(DIGE)

Ettan DIGE荧光差异蛋白表达分析系统在传统双向电泳技术的基础上,结合了多重荧光分析的方法,在同一块胶上共同分离多个分别由不同荧光标记(Cy2,Cy3,Cy5)的样品,并第一次引入了内标的概念,极大地提高了结果的准确性,可靠性和重复性。在DIGE技术中,每个蛋白点都有它自己的内标,并且软件全自动根据每个蛋白点的内标对其表达量进行校准,保证所检测到的蛋白丰度变化是真实的。DIGE技术可检测到样品间小于10%的蛋白表达差异,统计学可信度达到95%以上。利用Ettan DIGE技术还可以对微量(少到5μg)样本进行蛋白质组学分析。

优点:

1、相对于2D,在检测大量样品时,由于不同样品可以跑同一块胶,大大减轻了工作量。

2、检测灵敏度更高  Detection Limit = 125 pg protein,大大节约了样品,特别是不易得到的珍贵样品。

3、检测动态范围更大—Dynamic range 104 -105

4、内标归一化 —— 采用内标而消除了胶与胶之间的差异造成的误差

5、统计学分析—— 利用DeCyder软件可以得到统计学可信的结果,极大降低操作者之间的偏差,并且将手工操作时间减少到几分钟。

 缺点:

因灵敏度偏高,部分低丰度差异蛋白质的质谱鉴定结果往往失败。

仪器:

1st dimension:

IEF: IPG-PhorII (GE) and Protean IEF (BioRad)

2nd dimension:

GE Ruby SE600 (16x16cm)

GE Ettan DALTsix (26x20cm)

BioRad Criterion pre-cast (13x9cm)

BioRad Protean (8.6x7cm)

Data acquisition:

GE Typhoon 9400 Scanner

Analysis software:

GE DeCyder for DIGE gels

 

四、质谱鉴定(考染和银染)(MS Identification)

原理:

一、利用MALDI-TOF质谱仪,根据肽质量指纹图谱(Peptide Mass Fingerprinting, PMF)与蛋白质数据库中蛋白质的理论PMF比对,就可以鉴定该蛋白质。

优点

速度快,通量高,方法简便。

缺点

肽段分子量精确度往往不够理想,影响鉴定结果。肽段分子质量在2000以上时,在MALDI-TOF-MS中的分辨率会有所下降。蛋白质数据库仍不完善。

仪器:

AB Sciex MALDI-TOF/TOF 4800

Tecan Enzyme digestion workstation

样品要求:

1、操作需严格控制条件,防止角蛋白污染

2、样品状态:液体、固体或胶内蛋白质(接受考马斯亮兰染色和银染样品鉴定)

3、含盐量: 挥发性无机盐< 20 mM; 不挥发性无机盐< 5mM

4、不少于200ug /一块胶(银染);

5、胶内蛋白质鉴定,蛋白质样品量不少于1mg/一块胶(考马斯亮兰染色)

注意事项:

1、推荐采用考马斯亮兰染色。因为该方法的成功率较高,而银染的成功率则会低很多。

2、银染不得使用甲醛,因甲醛会影响酶解效率。

3、考马斯亮蓝染色样品的上样量>1mg

4、银染法得上样量>0.6mg

 

五、蛋白组表达谱构建(Shotgun proteomics)

原理:

针对液体或SDS-PAGE条带的复杂混合物用酶(Trypsin)酶解成肽段混合物,这些肽段混合物再通过液相色谱分离(如2DLC(阳离子柱SCX和C18反相柱串联)或1DLC 的C18反相柱),再用串联质谱测试,然后在相应的数据库检索进行鉴定,可同时鉴定成百上千种蛋白质。

优点:

     与传统的2D-gel比,一般的说来,Shotgun方法的灵敏度要高

缺点:

      会丢失一部分翻译后修饰的信息

仪器: 

AB Sciex

AB Eksigent nano LC

样品要求

1. 样品量>300μg,浓度>0.5mg/ml

2. 含盐量<50 mM

3. 注明样品制备的过程及所用的裂解液成分

4. 注明样品的组成成分(是否含脂类、色素、糖等)

5. 注明是否可以用沉淀、透析以及超滤等来除盐及杂质

 

六、蛋白质组标记定量(Proteome Labeling quanlity)

自1994年澳大利亚科学家Wilkins和Williams提出蛋白质组学的概念以来,已经过去了10年,在这10年中,蛋白质组学在生命科学及医学的各个研究领域蓬勃发展。尤其是在心脑管疾病、肿瘤、糖尿病等重大疾病的研究方面有巨大的贡献。但是,由于常规的2DE-MS分析途径本身固有的局限性,分辨率不高,重复性不好,偏向性严重等因素制约了蛋白质组学的进一步发展。因此逐步提出了定量蛋白质组学(quantitative proteomics)。

定量蛋白质组学是把一个基因组表达的全部蛋白质或一个复杂的混合体系巾所有的蛋白质进行精确的定量和鉴定的一门学科。这一概念的提出标志着蛋白质组技术的不断改进和完善.蛋白质组学研究已从对蛋白质简单的定性向精确的定量方向发展。

iTRAQ (isobaric tags for relative and absolute quantitation)技术是由美国应用生物系统公司ABI研发的一种多肽体外标记技术。该技术采用4种或8种同位素编码的标签,通过特异性标记多肽的氨基基团,尔后进行串联质谱分析,可同时比较4种或8种不同样品中蛋白质的相对含量或绝对含量。

原理:(以下均以4标为例)

 iTRAQ的4种同位素标记试剂由4种相对分子质量分别为114、115、116和117的报告基团(reporter group),相对分子质量分别为31、30、29 和28 的质量平衡基团(balance group)以及一个相同的肽反应标记试剂基团(peptide reactive group)组成。不同的报告基团分别与相应的平衡基团相配后,相对分子质量均为145,即等量异位标签(isobaric tag)。

将蛋白质裂解为肽段,然后用iTRAQ试剂进行差异标记。由于iTRAQ试剂是等量的,即不同同位素在标记同一多肽后在第一级质谱检测,分子量完全相同,用串联质谱方法对在第一级质谱检测到前体离子(precursor ion)进行碰撞诱导解离,产物离子通过第二级质谱进行分析。在二级质谱分析过程中,报告基团、质量平衡基团和多肽反应基团之间的键断裂,质量平衡基团丢失,产生低质荷比(m/z)的报告离子。由于二级质谱可分析相对分子质量相差1的报告基团,不同报告基团离子强度的差异就代表了它所标记的多肽的相对丰度。同时,多肽内的酰胺键断裂,形成一系列b 离子和y 离子,得到离子片段的质量数,通过数据库查询和比较,可以鉴定出相应的蛋白质前体.

 

实验流程:

技术特点:

1.可同时标记2~8 个样本。

2. iTRAQ技术不仅可发现胞浆蛋白,还有膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白。iTRAQ技术可检测出低丰度蛋白、强碱性蛋白、小于10KD或大于200KD的蛋白。

3.可标记修饰后的氨基酸,因此对磷酸化蛋白等翻译后修饰蛋白进行定性定量研究。

4.报告离子的相对分子质量较低(113~121),低分子量区是质谱定性(质量确定)和定量(丰度比较)较为准确的区域,因此质谱检测更为灵敏可靠。

 

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